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東富龍之整體解決方案-PCR實驗室核酸污染

引      言
       2020年4月18日,《華盛頓郵報》(WashingtonPost)爆出一則重磅新聞,美國CDC在實驗室生產的新冠病毒檢驗試劑出現了污染問題(圖1),導致全美的核酸檢測推遲最少一個月。2020年1月21日,美國CDC開發了新冠病毒檢測方法,1月下旬,美國CDC對26個公共衛生實驗室發放新冠病毒試劑盒,有24個實驗室出現了假陽性,美國CDC緊急召回診斷試劑,直到3月2日,IDT公司生產新冠試劑重新投入使用。由于實驗室污染,美國錯過了黃金的疫情防控窗口。

圖1 美國CDC在實驗室生產的新冠病毒檢驗試劑出現了污染問題


二、核酸污染與分類

2.1 核酸污染,PCR實驗室繞不開的“疼”

PCR(聚合酶鏈式反應簡稱)檢測因其靈敏度高、快速、操作方便等優勢被廣泛應用,不過正是由于它靈敏度極高,極微量的污染源都有可能導致檢測結果的假陽性。因此,如何避免以及處理實驗室污染,對PCR檢測人來說是一種挑戰。

2.2 PCR污染分類

(1)樣本間交叉污染:主要是在采(取)樣的過程中,由于取樣工具之間的交叉造成污染;或者在核酸提取的過程中,由于移液器、離心管等使用不當導致的樣本間污染。

(2)PCR試劑的污染:主要是在PCR試劑配制過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。

(3)克隆質粒的污染:在實驗室操作中經常會用到陽性參考品,這些陽性參考品大多數是由某些克隆質粒制作而成,克隆質粒在單位容積內濃度高,使用不當極易造成污染。

(4)CR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要、最常見,也是最令人頭疼的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可造成假陽性結果。



圖2 PCR產物拷貝量示意


三、擴增產物氣溶膠污染—核酸污染中的“牛皮蘚”

       PCR實驗室核酸污染中最難消除的是氣溶膠污染,尤其是擴增產物的氣溶膠污染。污染主要發生在PCR的擴增和產物分析階段。因為,PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/mL)(圖2),擴增產物液面與空氣摩擦時會形成氣溶膠。所以,比較劇烈地搖動反應管、開蓋時吸樣,以及反復吸樣都可形成氣溶膠污染。飛濺的擴增產物會形成氣溶膠漂浮在空氣中,粘附到物體表面及檢測人員身體上,隨著人員及物料流動而污染整個實驗室。如果這種污染能及時發現,實驗室空置幾天,采取積極有效的處理措施,情況會好轉。

四、PCR實驗室核酸污染傳統處理方法

4.1 物理方法

       使用紫外燈照射是目前PCR實驗室預防污染最常規的方法。由于DNA鏈上相鄰的嘧啶在254nm紫外誘導下發生交聯,嘧啶二聚體不能被切除,導致DNA聚合酶在空間上被阻礙或者DNA不能被完全變性,從而使擴增反應終止。由于小的擴增子只有較少的臨近嘧啶,所以該方法對小的擴增子效果不明顯,對富含G+C的和短的(<300bp)的擴增產物污染效果不大。

4.2 化學方法

      包括使用商品化的DNA去除劑、次氯酸鈉、1mol/L的鹽酸等各種化學物質去降解DNA。化學方法主要通過氧化損傷核酸的作用,從而使留在實驗室的擴增產物被破壞掉。

4.3 順其自然法

     停下所有實驗,靠通風和時間抹掉核酸的痕跡。

4.4 絕地求生法
 
     換一種試劑盒,只要兩種試劑的擴增產物不一致,沒有交叉反應,可以繼續做實驗。

五、PCR實驗室核酸污染的整體解決方案

     根據《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測手冊(試行第二版)》(聯防聯控機制醫療法〔2020〕313號)中提到:實驗室結束后空氣清潔要求。必要時可采用核酸清除劑等試劑清除實驗室殘留核酸(圖3)。





圖3《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測手冊(試行第二版)》的要求


5.1 多功能PCR氣溶膠清除儀—預防、清除氣溶膠污染的得力助手


圖4 東富龍多功能PCR氣溶膠污染清除儀NDS1025

       上海東富龍醫療裝備有限公司推出的全新多功能PCR氣溶膠污染清除儀NDS1025(圖4),能有效預防及清除實驗室空間中攜帶的PCR產物的氣溶膠。它采用特殊霧化裝置將獨有配方的氣溶膠清除劑霧化成小于10μm的液滴。當液滴的平均直徑小于10μm時,噴出的微米級液滴會均勻分散在空間的物體表面,并懸浮在空氣中較長時間,滲透能力強,與空氣中的PCR產物氣溶膠充分接觸,清除劑通過破壞DNA的嘌呤和嘧啶堿的共軛雙鍵,對DNA有實質性破壞作用,從而達到清除的目的。同時,該儀器配備高效復合型過濾器,集成有納米多功能初效層,HEPA和復合復碳層,通過物理吸附、高效過濾結合有效的清除劑,有效降低PCR產物氣溶膠污染。獨有的專用氣溶膠清除劑配方,高效、安全、無污染,被世界衛生組織列為A1級清除劑,無殘留,無腐蝕。該儀器使用便捷,可移動,清除耗時短(清除過程≤1小時),噪音小、試劑用量少,配置方便快捷。可廣泛使用于PCR實驗室樣本處理區、核酸提取區、試劑配制區、PCR擴增或檢測區,適用于醫院檢驗科、疾控、海關、食藥監、血站、科研院校等PCR實驗室。圖5為RCR氣溶膠清除儀使用效果驗證示意。



圖5 RCR氣溶膠清除儀使用效果驗證示意

5.2 DNA cleaner——物表核酸污染高效清除的新選擇

       為配合氣溶膠清除儀對物表核酸污染的高效清除,配套的DNACleaner采用接觸催化協同作用,非酶性高效降解PCR產物或DNA/RNA,高效防止PCR假性的擴增。該型清除劑使用簡單,物表噴灑A試劑10min后,噴灑蒸餾水或75%酒精后擦拭即可;不影響實驗結果,無腐蝕性和致癌性,不會殘留在表面對人體和機器造成傷害。適用于實驗臺、PCR儀、移液器、離心機及地面等物表的PCR產物或DNA和RNA污染的清除。圖6為污染的實驗室臺面使用圖DNACleaner后效果驗證示意。



圖6 污染的實驗室臺面使用圖DNACleaner后效果驗證示意

結     語

       PCR實驗室污染引起的檢測結果假陽性風險極大,因此需要采取積極有效的預防措施。進行PCR操作時,操作人員應該嚴格遵守一些操作規程,最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。實驗結束后,對實驗室環境進行清潔,必要時采用核酸清除劑等試劑清除實驗室殘留核酸。東富龍多功能PCR氣溶膠污染清除儀可有效預防和清除氣溶膠核酸污染,保障實驗室安全。
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